O-糖基化作為常見的翻譯后修飾，參與著各種重要的生命活動(dòng)。與N-糖修飾相比，O-糖具有豐度低、核心結(jié)構(gòu)復(fù)雜且多樣等特點(diǎn)，由于缺乏恒定修飾序列（可隨機(jī)修飾在絲氨酸、蘇氨酸和羥賴氨酸上）以及缺乏特異性切O-糖工具酶，蛋白O-糖的鑒定一直被視為行業(yè)難題。
CD24（Cluster of Differentiation 24）是一種高度糖基化的糖基磷脂酰肌醇錨定表面蛋白，高表達(dá)于多種惡性腫瘤表面，利用其高度糖基化的結(jié)構(gòu)與腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞上的抑制性受體Siglec-10（唾液酸結(jié)合免疫球蛋白型凝集素）相互作用，發(fā)出“don't eat me”信號(hào)，促進(jìn)免疫逃逸。
CD24Fc是一種重組人CD24胞外域和人免疫球蛋白IgG1 Fc端的融合蛋白。既可以阻斷CD24與Siglec-10相互作用，來(lái)增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對(duì)表達(dá)CD24的腫瘤細(xì)胞吞噬作用，又可以增強(qiáng)體內(nèi)半衰期，同時(shí)Fc融合蛋白形式的二聚體也增強(qiáng)了藥物穩(wěn)定性。但由于CD24存在高度密集的N-/O-糖基化修飾位點(diǎn)，復(fù)雜的糖型（圖1），使得CD24Fc藥物研發(fā)中糖分析異乎尋常地困難。
近日，漢騰生物歐洲子公司FyoniBio的Robert Wilmanowski博士等人的研究成果《Precise O?Glycosylation Site Localization of CD24Fc by LC-MS Workflows》刊登在Analytical Chemistry雜志，首次利用多種酶切策略結(jié)合LC-MS的CID裂解和EThcD裂解技術(shù)互補(bǔ)分析，在糖肽層面，精確定位了CD24Fc蛋白中所有O-糖修飾位點(diǎn)和糖型分布，對(duì)CD24Fc融合蛋白的藥物開發(fā)有著重要意義，同時(shí)也為致力于O-糖組成，O-糖位點(diǎn)分析的研究者們提供了新的方法。
二、分析流程
為降低目標(biāo)蛋白復(fù)雜度，研究者采用IdeS酶切結(jié)合ProA純化，在亞基層面富集到CD24蛋白后采用PNGaseF和Trypsin酶切。如圖2（左）所示，得到去除N-糖含完整CD24序列的結(jié)構(gòu)域組分，利用LC-MS技術(shù)，針對(duì)包含1-32位氨基酸的糖肽片段進(jìn)行分析，獲得CD24（CD24部分僅含31個(gè)氨基酸）上所有O-糖單元組成及相對(duì)含量。（見圖3，x_y_z分別代表NeuAc(x)_Hex(y)_HexNAc(z) 糖單元的個(gè)數(shù)）。
由于OpeRATOR酶具備特異性酶切O-糖基化后的S/T的N端肽鍵的特性（聯(lián)合SialEXO唾液酸切除酶可提高效率）。首先使用Asp-N將CD24序列切成3段，然后利用SialEXO和OpeRATOR酶切特性，繼續(xù)縮短糖肽長(zhǎng)度，且再次酶切所得的肽段N端氨基酸即為O-糖基化位點(diǎn)。如圖2（右）所示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CD24主要O-糖位點(diǎn)為T25和T15，而T4，T5，T7，S12，S28存在少量的O糖修飾。
此外，研究者還采用OpeRATOR/SialEXO酶結(jié)合PNGaseF和Lys-C酶切，獲得含不同氨基酸的糖肽，結(jié)合LC-MS/MS（EThcD模式）對(duì)O-糖位點(diǎn)精細(xì)研究鑒定，可得T25，T15為主要O-糖修飾位點(diǎn)，T4, T5，S12，S14，S16，S18，T28存在少量O糖修飾，而T3，T7，T11存在微量的O-糖修飾。
三、鑒定結(jié)果
綜合兩種分析流程（LC-MS CID和EThcD裂解技術(shù)），結(jié)合多種酶（IdeS, Asp-N, PNGaseF, OpeRATOR, SialEXO, Trypsin, Lys-C），確定了CD24Fc融合蛋白的O-糖基化位點(diǎn)和O-糖基化相對(duì)修飾程度，如圖5所示，結(jié)果顯示CD24Fc蛋白共包含12個(gè)O-糖基化位點(diǎn)，其中 7個(gè)O-糖基化位點(diǎn)在兩種分析流程均得到驗(yàn)證，另有5個(gè)O-糖基化位點(diǎn)可以被ETHcD裂解分析流程驗(yàn)證，如圖5（下）。
該研究首次精確確證了CD24 O-糖基化位點(diǎn)和相對(duì)修飾程度，填補(bǔ)了CD24蛋白O-糖基化修飾的空白領(lǐng)域，拓寬了LC-MS在糖肽水平O-糖基化研究策略，同時(shí)也為CD24信號(hào)療法的藥物研發(fā)提供堅(jiān)實(shí)可靠的理論結(jié)構(gòu)依據(jù)。
關(guān)于FyoniBio GmbH
FyoniBio GmbH是漢騰生物全資歐洲子公司，專注于生物大分子藥物開發(fā)及分析服務(wù) ，核心團(tuán)隊(duì)成員具備20年以上的生物制藥開發(fā)經(jīng)驗(yàn)。公司可為全球生物制藥客戶提供細(xì)胞系開發(fā)、上下游工藝開發(fā)、分析方法開發(fā)及臨床生物檢測(cè)等專業(yè)服務(wù)。目前已為多家跨國(guó)藥企及生物技術(shù)公司提供高品質(zhì)的生物藥開發(fā)及分析服務(wù)。
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參考文獻(xiàn)：Precise O?Glycosylation Site Localization of CD24Fc by LC-MS Workflows
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