DNA 序列轉(zhuǎn)化為完全正確折疊的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的過程極為復(fù)雜，涉及轉(zhuǎn)錄、翻譯、翻譯后修飾、蛋白質(zhì)折疊和最終分泌等數(shù)個步驟，其中任何一個步驟出現(xiàn)問題均能影響蛋白質(zhì)的表達(dá)[1]，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白降解、聚集及引起細(xì)胞毒性等 [1]。
通常，對于候選治療性蛋白藥物，尤其是單、雙抗藥物的設(shè)計(jì)改造目的主要為增加其對靶點(diǎn)蛋白的親和力或改善其熱穩(wěn)定性，很少評估它們在宿主細(xì)胞系，例如 CHO 細(xì)胞中的表達(dá)難易程度[2]。而生物藥物候選分子在開發(fā)早期的低表達(dá)量是導(dǎo)致產(chǎn)品早期開發(fā)終止的主要原因之一。
難表達(dá)治療性蛋白通常是那些轉(zhuǎn)錄、翻譯和折疊/組裝反應(yīng)速率不匹配的蛋白藥物，包括類毒素、酶、膜蛋白、部分單、雙抗、以及疏水性較強(qiáng)的蛋白質(zhì)[3,4]。協(xié)調(diào)優(yōu)化各種相互關(guān)聯(lián)的動態(tài)過程（從基因序列到分泌蛋白）是優(yōu)化產(chǎn)物收率的必要條件[3]。
漢騰解決方案
為解決這一難題，漢騰生物針對難表達(dá)蛋白藥物開發(fā)了 DTEasy 工具箱，可集成并優(yōu)化難表達(dá)蛋白表達(dá)過程中的各個關(guān)鍵階段，成功提高蛋白產(chǎn)量，以助力蛋白藥物分子順利實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。
01 分子改良策略
? 基于氨基酸序列分析和蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測，通過引入點(diǎn)突變、優(yōu)化氨基酸序列；
? 進(jìn)行蛋白截短、融合表達(dá)標(biāo)簽蛋白；
? 篩選適合的 抗體藥物VH/VL 框架對，基因工程優(yōu)化重、輕鏈序列等；以改善蛋白的三維結(jié)構(gòu)，提高蛋白熱穩(wěn)定性。
02 宿主選擇策略
相較其它表達(dá)系統(tǒng)宿主，哺乳動物細(xì)胞具有更優(yōu)異的蛋白質(zhì)折疊和二硫鍵形成能力[5]。不同種類哺乳動物細(xì)胞的糖基化能力也有所不同，對于表達(dá)糖基化修飾要求較高的蛋白，如凝血因子等，可選用漢騰獨(dú)家開發(fā)的GlycoExpress® （GEX）細(xì)胞系。
此外，表達(dá)一些組織特異性較高的蛋白，如G蛋白受體 （GPCR）胞外結(jié)構(gòu)域， 相較于傳統(tǒng)的CHO細(xì)胞系， 該蛋白在GEX® 細(xì)胞中的表達(dá)量可提升十倍。
03 載體優(yōu)化策略
通過轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)分析，將與難表達(dá)蛋白產(chǎn)量正相關(guān)的順式作用元件插入到表達(dá)載體中，選擇多拷貝載體及難表達(dá)蛋白專用載體，或共表達(dá)蛋白抑制劑、配體等。
04 工藝構(gòu)建
在細(xì)胞培養(yǎng)過程中可添加專用添加劑，針對不同的細(xì)胞制定對應(yīng)的篩選以及培養(yǎng)工藝，以提高活細(xì)胞密度并有助于延長培養(yǎng)時(shí)間，最終達(dá)到提升產(chǎn)量的目的。DTEasy 專有添加劑可只需在培養(yǎng)過程中簡單的單次添加，即可最高提升 3 倍表達(dá)量。漢騰生物建立的 CBoost® 加強(qiáng)型工藝平臺，加強(qiáng)型補(bǔ)料批培養(yǎng)可達(dá)到超過兩倍的蛋白表達(dá)量。此外，由于細(xì)胞需要平衡蛋白表達(dá)和生長，外源蛋白表達(dá)會給細(xì)胞造成較大壓力[6]。針對這一特點(diǎn)，漢騰生物采用了更為溫和的環(huán)軌搖晃式反應(yīng)器，操作簡便的同時(shí)，還可以縮短混合時(shí)間、降低剪切應(yīng)力、減少泡沫及污染。
案例一
信號肽位于分泌蛋白的 N 端，引導(dǎo)新合成的蛋白質(zhì)進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔．而信號肽序列則在信號肽酶的作用下被切除。信號肽篩選是增強(qiáng)蛋白分泌的一種重要途徑。選擇不同的信號肽會導(dǎo)致不同的融合蛋白 N 端截短比例，進(jìn)而可能對融合蛋白的純度和活性產(chǎn)生影響。
針對重組胰高血糖素樣肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）項(xiàng)目，漢騰生物設(shè)計(jì)了多種信號肽用于增強(qiáng) GLP-1 蛋白或 GLP-1 融合蛋白在宿主細(xì)胞中的表達(dá)（結(jié)果如下，詳細(xì)內(nèi)容參考漢騰專利：信號肽在表達(dá)GLP-1融合蛋白中的應(yīng)用,CN114539357B）。通過不同信號肽的組合，藥物蛋白的純度和生物學(xué)活性得以顯著提升（表 1）。
表1. 細(xì)胞培養(yǎng)上清中 GLP-1-Fc 融合蛋白的表達(dá)量以及純化后融合蛋白純度
案例二
對于某些過量表達(dá)后會引起細(xì)胞毒性的蛋白質(zhì)，如蛋白酶和凝血酶，可以考慮共表達(dá)其抑制劑，減少其表達(dá)給細(xì)胞存活造成的壓力，從而提高蛋白產(chǎn)量。
針對組織型纖溶酶源激活劑（tissue plasminogen activator，t-PA），漢騰生物構(gòu)建了共表達(dá) t?PA 和 t?PA 抑制劑的雙表達(dá)框載體以及一步層析純化工藝（結(jié)果如下，詳細(xì)內(nèi)容參考漢騰專利：t-PA純化方法，CN14426962B）。其中 t?PA 與 t?PA 抑制劑形成的非共價(jià)復(fù)合物結(jié)構(gòu)松散，易于分離。此外，目前 t?PA 的純化工藝一般需要 3～4 步才能實(shí)現(xiàn) 90％以上的純度，共表達(dá) t?PA 抑制劑后結(jié)合使用賴氨酸親和層析，能夠?qū)崿F(xiàn) t?PA 的一步層析純化（圖 1）。最終 tPA 的純化后產(chǎn)率達(dá) 361.5 mg/L，是現(xiàn)有技術(shù)的 3 倍以上。
圖 1. 賴氨酸親和層析結(jié)果
案例三
商業(yè)生產(chǎn)中使用細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)充足蛋白質(zhì)的方法主要分為三種：分批培養(yǎng)、補(bǔ)料分批培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)。分批培養(yǎng)方法中，所有營養(yǎng)物質(zhì)都在初始基培養(yǎng)基中提供，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長，營養(yǎng)物質(zhì)不斷減少，乳酸等代謝抑制物增加。補(bǔ)料分批培養(yǎng)是指在培養(yǎng)過程中，間歇或連續(xù)地補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基，可以避免細(xì)胞和代謝過程中的產(chǎn)物以及某些營養(yǎng)物質(zhì)的缺乏對細(xì)胞的抑制作用。連續(xù)培養(yǎng)是培養(yǎng)過程中不斷灌注培養(yǎng)基能同時(shí)清除廢物、提供營養(yǎng)和收獲產(chǎn)品的培養(yǎng)方法。針對不同的難表達(dá)蛋白選擇更合適的細(xì)胞培養(yǎng)方式以及額外補(bǔ)充專用添加劑，有助于提升蛋白產(chǎn)量。
此前，并無高效表達(dá)人類神經(jīng)生長因子（human never growth factor，hNGF）的培養(yǎng)方法，極大限制了 hNGF 的大規(guī)模生產(chǎn)和在臨床與藥物方面的應(yīng)用。漢騰生物采用補(bǔ)料分批培養(yǎng)方法，并發(fā)現(xiàn)了新的添加劑，可以將 hNGF 重組蛋白的表達(dá)量提高至少 100%，產(chǎn)量最高可提升至 2900 mg/L左右（圖 2），較大地提升了 hNGF 在 CHO 細(xì)胞中的表達(dá)水平（詳細(xì)內(nèi)容參考漢騰專利：重組神經(jīng)生長因子的高效表達(dá)方法，CN2023108028220）。
圖 2. 含有不同濃度添加劑的培養(yǎng)基條件下 β-NGF 蛋白表達(dá)量的柱形圖
案例四
攪拌式生物反應(yīng)器是細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域常用的反應(yīng)器，由于其攪拌槳易造成剪切力，且其深層通氣方式易產(chǎn)生泡沫從而造成更巨大的剪接力，會對細(xì)胞造成傷害，甚至死亡。此外，攪拌式生物反應(yīng)器在擴(kuò)大培養(yǎng)過程中，由于涉及的參數(shù)較多，流體力學(xué)復(fù)雜，造成放大困難，甚至失敗。
環(huán)軌搖晃式生物反應(yīng)器是一種通過環(huán)軌搖晃混合方式進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的生物反應(yīng)器，可以很好地解決攪拌式生物反應(yīng)器存在的問題。但由于工作原理存在較大差異，攪拌式生物反應(yīng)器的培養(yǎng)條件并不適用環(huán)軌搖晃式生物反應(yīng)器。為解決這一問題，漢騰生物成功開發(fā)了一種細(xì)胞培養(yǎng)的方法（詳細(xì)內(nèi)容參考一種使用環(huán)軌搖晃式生物反應(yīng)器培養(yǎng)細(xì)胞的方法，CN113862224A）。該方法采用梯度增速及降溫的方式培養(yǎng)細(xì)胞，同時(shí)對培養(yǎng)基進(jìn)行適當(dāng)優(yōu)化，細(xì)胞活率以及蛋白表達(dá)量更高（圖 3-4）。
圖 3. 活細(xì)胞密度（VCD）和細(xì)胞活率（VIA）。SB-10：環(huán)軌搖晃式生物反應(yīng)器；AK02：3 L攪拌式生物反應(yīng)器；AK15：15 L攪拌式生物反應(yīng)器
圖 4. 蛋白表達(dá)量。SB-10：環(huán)軌搖晃式生物反應(yīng)器；AK02：3 L攪拌式生物反應(yīng)器；AK15：15 L攪拌式生物反應(yīng)器
綜上，漢騰DTEasy平臺通過先進(jìn)的分子設(shè)計(jì)、載體優(yōu)化、宿主細(xì)胞系的精細(xì)篩選以及定制化工藝，成功解決了多種類型蛋白質(zhì)的難表達(dá)問題，我們期待為您提供定制化服務(wù)！
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漢騰專利（本文相關(guān)）
1. 信號肽在表達(dá)GLP-1融合蛋白中的應(yīng)用[P].廣東省:CN202011358998.4,2024-07-30.
2.t-PA純化方法[P].廣東省:CN202111574380.6,2024-06-18.
3.重組神經(jīng)生長因子的高效表達(dá)方法[P].廣東省:CN202310802822.0,2023-11-10.
4.一種使用環(huán)軌搖晃式生物反應(yīng)器培養(yǎng)細(xì)胞的方法[P].廣東省:CN202010618579.3,2021-12-31.
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