DNA 序列轉化為完全正確折疊的蛋白質產物的過程極為復雜，涉及轉錄、翻譯、翻譯后修飾、蛋白質折疊和最終分泌等數個步驟，其中任何一個步驟出現問題均能影響蛋白質的表達[1]，進而導致蛋白降解、聚集及引起細胞毒性等 [1]。
通常，對于候選治療性蛋白藥物，尤其是單、雙抗藥物的設計改造目的主要為增加其對靶點蛋白的親和力或改善其熱穩(wěn)定性，很少評估它們在宿主細胞系，例如 CHO 細胞中的表達難易程度[2]。而生物藥物候選分子在開發(fā)早期的低表達量是導致產品早期開發(fā)終止的主要原因之一。
難表達治療性蛋白通常是那些轉錄、翻譯和折疊/組裝反應速率不匹配的蛋白藥物，包括類毒素、酶、膜蛋白、部分單、雙抗、以及疏水性較強的蛋白質[3,4]。協(xié)調優(yōu)化各種相互關聯的動態(tài)過程（從基因序列到分泌蛋白）是優(yōu)化產物收率的必要條件[3]。
漢騰解決方案
為解決這一難題，漢騰生物針對難表達蛋白藥物開發(fā)了 DTEasy 工具箱，可集成并優(yōu)化難表達蛋白表達過程中的各個關鍵階段，成功提高蛋白產量，以助力蛋白藥物分子順利實現產業(yè)化。
01 分子改良策略
? 基于氨基酸序列分析和蛋白結構預測，通過引入點突變、優(yōu)化氨基酸序列；
? 進行蛋白截短、融合表達標簽蛋白；
? 篩選適合的 抗體藥物VH/VL 框架對，基因工程優(yōu)化重、輕鏈序列等；以改善蛋白的三維結構，提高蛋白熱穩(wěn)定性。
02 宿主選擇策略
相較其它表達系統(tǒng)宿主，哺乳動物細胞具有更優(yōu)異的蛋白質折疊和二硫鍵形成能力[5]。不同種類哺乳動物細胞的糖基化能力也有所不同，對于表達糖基化修飾要求較高的蛋白，如凝血因子等，可選用漢騰獨家開發(fā)的GlycoExpress® （GEX）細胞系。
此外，表達一些組織特異性較高的蛋白，如G蛋白受體 （GPCR）胞外結構域， 相較于傳統(tǒng)的CHO細胞系， 該蛋白在GEX® 細胞中的表達量可提升十倍。
03 載體優(yōu)化策略
通過轉錄組差異表達分析，將與難表達蛋白產量正相關的順式作用元件插入到表達載體中，選擇多拷貝載體及難表達蛋白專用載體，或共表達蛋白抑制劑、配體等。
04 工藝構建
在細胞培養(yǎng)過程中可添加專用添加劑，針對不同的細胞制定對應的篩選以及培養(yǎng)工藝，以提高活細胞密度并有助于延長培養(yǎng)時間，最終達到提升產量的目的。DTEasy 專有添加劑可只需在培養(yǎng)過程中簡單的單次添加，即可最高提升 3 倍表達量。漢騰生物建立的 CBoost® 加強型工藝平臺，加強型補料批培養(yǎng)可達到超過兩倍的蛋白表達量。此外，由于細胞需要平衡蛋白表達和生長，外源蛋白表達會給細胞造成較大壓力[6]。針對這一特點，漢騰生物采用了更為溫和的環(huán)軌搖晃式反應器，操作簡便的同時，還可以縮短混合時間、降低剪切應力、減少泡沫及污染。
案例一
信號肽位于分泌蛋白的 N 端，引導新合成的蛋白質進入內質網腔．而信號肽序列則在信號肽酶的作用下被切除。信號肽篩選是增強蛋白分泌的一種重要途徑。選擇不同的信號肽會導致不同的融合蛋白 N 端截短比例，進而可能對融合蛋白的純度和活性產生影響。
針對重組胰高血糖素樣肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）項目，漢騰生物設計了多種信號肽用于增強 GLP-1 蛋白或 GLP-1 融合蛋白在宿主細胞中的表達（結果如下，詳細內容參考漢騰專利：信號肽在表達GLP-1融合蛋白中的應用,CN114539357B）。通過不同信號肽的組合，藥物蛋白的純度和生物學活性得以顯著提升（表 1）。
表1. 細胞培養(yǎng)上清中 GLP-1-Fc 融合蛋白的表達量以及純化后融合蛋白純度
案例二
對于某些過量表達后會引起細胞毒性的蛋白質，如蛋白酶和凝血酶，可以考慮共表達其抑制劑，減少其表達給細胞存活造成的壓力，從而提高蛋白產量。
針對組織型纖溶酶源激活劑（tissue plasminogen activator，t-PA），漢騰生物構建了共表達 t?PA 和 t?PA 抑制劑的雙表達框載體以及一步層析純化工藝（結果如下，詳細內容參考漢騰專利：t-PA純化方法，CN14426962B）。其中 t?PA 與 t?PA 抑制劑形成的非共價復合物結構松散，易于分離。此外，目前 t?PA 的純化工藝一般需要 3～4 步才能實現 90％以上的純度，共表達 t?PA 抑制劑后結合使用賴氨酸親和層析，能夠實現 t?PA 的一步層析純化（圖 1）。最終 tPA 的純化后產率達 361.5 mg/L，是現有技術的 3 倍以上。
圖 1. 賴氨酸親和層析結果
案例三
商業(yè)生產中使用細胞培養(yǎng)生產充足蛋白質的方法主要分為三種：分批培養(yǎng)、補料分批培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)。分批培養(yǎng)方法中，所有營養(yǎng)物質都在初始基培養(yǎng)基中提供，隨著培養(yǎng)時間延長，營養(yǎng)物質不斷減少，乳酸等代謝抑制物增加。補料分批培養(yǎng)是指在培養(yǎng)過程中，間歇或連續(xù)地補加新鮮培養(yǎng)基，可以避免細胞和代謝過程中的產物以及某些營養(yǎng)物質的缺乏對細胞的抑制作用。連續(xù)培養(yǎng)是培養(yǎng)過程中不斷灌注培養(yǎng)基能同時清除廢物、提供營養(yǎng)和收獲產品的培養(yǎng)方法。針對不同的難表達蛋白選擇更合適的細胞培養(yǎng)方式以及額外補充專用添加劑，有助于提升蛋白產量。
此前，并無高效表達人類神經生長因子（human never growth factor，hNGF）的培養(yǎng)方法，極大限制了 hNGF 的大規(guī)模生產和在臨床與藥物方面的應用。漢騰生物采用補料分批培養(yǎng)方法，并發(fā)現了新的添加劑，可以將 hNGF 重組蛋白的表達量提高至少 100%，產量最高可提升至 2900 mg/L左右（圖 2），較大地提升了 hNGF 在 CHO 細胞中的表達水平（詳細內容參考漢騰專利：重組神經生長因子的高效表達方法，CN2023108028220）。
圖 2. 含有不同濃度添加劑的培養(yǎng)基條件下 β-NGF 蛋白表達量的柱形圖
案例四
攪拌式生物反應器是細胞培養(yǎng)領域常用的反應器，由于其攪拌槳易造成剪切力，且其深層通氣方式易產生泡沫從而造成更巨大的剪接力，會對細胞造成傷害，甚至死亡。此外，攪拌式生物反應器在擴大培養(yǎng)過程中，由于涉及的參數較多，流體力學復雜，造成放大困難，甚至失敗。
環(huán)軌搖晃式生物反應器是一種通過環(huán)軌搖晃混合方式進行細胞培養(yǎng)的生物反應器，可以很好地解決攪拌式生物反應器存在的問題。但由于工作原理存在較大差異，攪拌式生物反應器的培養(yǎng)條件并不適用環(huán)軌搖晃式生物反應器。為解決這一問題，漢騰生物成功開發(fā)了一種細胞培養(yǎng)的方法（詳細內容參考一種使用環(huán)軌搖晃式生物反應器培養(yǎng)細胞的方法，CN113862224A）。該方法采用梯度增速及降溫的方式培養(yǎng)細胞，同時對培養(yǎng)基進行適當優(yōu)化，細胞活率以及蛋白表達量更高（圖 3-4）。
圖 3. 活細胞密度（VCD）和細胞活率（VIA）。SB-10：環(huán)軌搖晃式生物反應器；AK02：3 L攪拌式生物反應器；AK15：15 L攪拌式生物反應器
圖 4. 蛋白表達量。SB-10：環(huán)軌搖晃式生物反應器；AK02：3 L攪拌式生物反應器；AK15：15 L攪拌式生物反應器
綜上，漢騰DTEasy平臺通過先進的分子設計、載體優(yōu)化、宿主細胞系的精細篩選以及定制化工藝，成功解決了多種類型蛋白質的難表達問題，我們期待為您提供定制化服務！
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漢騰專利（本文相關）
1. 信號肽在表達GLP-1融合蛋白中的應用[P].廣東省:CN202011358998.4,2024-07-30.
2.t-PA純化方法[P].廣東省:CN202111574380.6,2024-06-18.
3.重組神經生長因子的高效表達方法[P].廣東省:CN202310802822.0,2023-11-10.
4.一種使用環(huán)軌搖晃式生物反應器培養(yǎng)細胞的方法[P].廣東省:CN202010618579.3,2021-12-31.
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